Protéinase K, 200 mg

Catégorie: Sérine endopeptidase (hydrolase)

Numéro CE: 3.4.21.64

Type de réaction: clivage protéolytique

Poids moléculaire: 28,9 kDa

Organisme d'origine: Tritirachium album

Organisme d'expression: Komagataella phaffii (Pichia pastoris)

Forme: Lyophilisat (poudre blanche)

Pureté: teneur en protéines > 70
                  Teneur en ADN ≤ 10 pg/mg ; ≤ 200 pg/ml

Activité: ≥ 30 U/mg (1 U = 1 mAnsonU)

Une U protéinase K hydrolyse l'hémoglobine dénaturée par l'urée et produit l'équivalent en couleur de 1 µmol de tyrosine par 1 min à 37°C et pH 7,5 (méthode Folin & Ciocalteu).

Stabilité: pH 4,0-12,5 (pH optimal : 7,5 - 8,0) ; également stable en présence d'agents dénaturants (SDS, urée).
                   Les ions Ca2+ (1-5 mM) protègent l'enzyme contre l'autolyse.

Activateurs: SDS, urée (l'activation par autodigestion n'est pas nécessaire).

Inhibiteurs: ions Hg2+, PMFS, phénol, DFP, inhibiteurs de trypsine ou de chymotrypsine, réactifs sulfhydrylés

Thermostabilité: actif à 37-56°C (activation optimale à 50-55°C)

Inactivation: dénaturation par la chaleur à 75°C pendant 20 min.

Stockage: -20°C

Solubilisation: 20 mg/mL : dissolution dans 50 ml d'eau distillée
                              20-50 mg/mL : dissolution dans un volume défini de 50 mM Tris-HCl (pH 7,5 - 8,0), 1-5 mM Ca2+ (chlorure de calcium, acétate de calcium)
                                                      ou 10 mM Tris-HCl (pH 7,5 - 8,0), 1-5 mM Ca2+ (chlorure de calcium, acétate de calcium)

                              Pour le stockage à long terme, ajouter 50% de glycérol.

Tampon de réaction standard: lyse cellulaire : 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM CaCl2, 0,5% SDS
                                              Purification de l'ADN : 100 mM Tris-HCl (pH 8,0), 50 mM EDTA, 500 mM NaCl

Sécurité: H315 + H319 + H334 + H317 + H335
                     P260 + P280 + P342 + P311

Numéro CAS: 39450-01-6

1. comment préparer une solution de bâtonnet de protéinase K ?

      20 mg/mL: Dissolvez le lyophilisat dans 50 ml d'eau distillée pour une utilisation immédiate.
                         Filtrez la solution de manière stérile et stockez-la aliquotée à -20°C.
20-50 mg/mL: dissoudre le lyophilisat dans un volume défini dans du Tris-HCl 50 mM (pH 7,5 - 8,0), du Ca2+ 1-5 mM (chlorure de calcium, acétate de calcium)
                         ou 10 mM Tris-HCl (pH 7,5 - 8,0), 1-5 mM Ca2+ (chlorure de calcium, acétate de calcium) pour une utilisation immédiate.
                         Filtrer la solution de manière stérile et la stocker aliquotée à -20°C.

                         Pour le stockage à long terme, ajoutez 50% de glycérol.

2. pour quelles applications ai-je besoin de la protéinase K ?

•     Isolation d'ADN génomique à partir de queues de souris:

                        Tampon: Tris-HCl 20 mM (pH 8,0), NaCl 400 mM, EDTA 5 mM (pH 8,0), SDS 1%.
                        Concentration: 400 µg/ml de protéase K
                        Durée: toute la nuit
                        Température: 55°C

•     Isolation de l'ADN génomique à partir de cellules en culture:

                        Tampon: 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 50 mM NaCl, 100 mM EDTA (pH 8,0), 0,5% SDS, 20 µg/ml DNase ARNse libres
                        Concentration: 100 µg/ml protéase K
                        Durée: 3h
                        Température: 50°C

•     Isolation rapide de l'ADN génomique (matrice PCR):

                        Tampon: 67 mM Tris-HCl (pH 8,8), 16,6 mM sulfate d'ammonium, 5 mM β-mercaptoéthanol, 6,7 mM MgCl2, 6,7 µM EDTA (pH 8,0), 1,7 µM SDS
                        Concentration: 50 µg/ml protéase K
                        Durée: 1h
                        Température: 37°C

•     Purification de l'ARNm avant la synthèse de l'ADNc (Augmente souvent le rendement):

                        Tampon: 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 50 mM NaCl, 10 mM EDTA (pH 8,0), 0,1% SDS
                        Concentration: 5 µg/ml protéase K
                        Durée: 1-2h
                        Température: 37°C

•     Purification des amorces PCR avant le clonage:

                        Préparation: Amorces de PCR + 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 400 mM NaCl, 5 mM EDTA (pH 8,0), 1% SDS
                        Concentration: 400 µg/ml de protéase K
                        Durée: toute la nuit
                        Température: 55°C

•     Purification de l'ADN plasmidique avant la transcription in vitro:

                        Préparation: ADN plasmidique + Tris-HCl 21 mM (pH 8,0), NaCl 50 mM, EDTA 5 mM (pH 8,0), SDS 0,5%.
                        Concentration: 100 µg/ml protéase K
                        Durée: 1h
                        Température: 37°C

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