Protéinase K, 1 g
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- Article number BS20.2505
Protéinase K (1 g)
Lyophilisée, ≥ 30 U/mg ; Enzyme recombinante ; Exprimée dans Komagataella phaffii (Pichia pastoris) ; MW : 28.9 kDa
Synonyme(s)
Endopeptidase K, Pro-k, Protéinase K
Description du produit
Notre protéinase K est une sérine protéase non spécifique avec une activité protéolytique très élevée (30 U/mg). L'enzyme a été exprimée dans Komagataella phaffii (Pichia pastoris) et est exempte de nucléases endogènes (ADNsen, ARNsen) et d'exonucléases. En raison de sa grande efficacité dans la digestion des protéines natives, la protéase convient très bien à l'isolement de l'ADN génomique à partir de cellules ou de tissus cultivés (p. ex. queues de souris) et à l'inactivation fiable des nucléases endogènes (ADNsen, ARNsen) pendant la préparation de l'ADN/ARN.
Propriétés
- Grande stabilité dans une large gamme de pH (4,0 - 12,5 ; optimal à pH 7,5 - 8,0)
- Activité élevée à des températures allant jusqu'à 56°C et dans des conditions dénaturantes (actif en présence de SDS, d'urée et d'EDTA)
- Efficacité élevée à faible dose (50-100 µg/ml suffisent pour la plupart des applications)
Bon à savoir
La protéinase K est sécrétée par des cultures de la moisissure Tritirachium album et sert naturellement à la digestion de la kératine ('K') du champignon pour couvrir son budget en carbone et en azote. La protéinase K est structurellement stabilisée par les ions Ca2+ et clive de préférence les liaisons peptidiques des acides aminés aliphatiques, aromatiques ou autres acides aminés hydrophobes (C-terminal). En l'absence d'ions Ca2+, la protéinase K présente une activité légèrement réduite. L'activité globale reste néanmoins élevée, c'est pourquoi une digestion par la protéinase K peut également être réalisée en présence d'EDTA. Les agents dénaturants comme le SDS ou l'urée servent d'activateurs à l'enzyme. L'activité de la protéase est inhibée par les ions Hg2+, le DFP, le PMSF, le phénol, les réactifs sulfhydrylés et les inhibiteurs de trypsine ou de chymotrypsine.
Vous trouverez volontiers des exemples d'application de la protéinase K sous FAQ !
Catégorie: Sérine endopeptidase (hydrolase)
Numéro CE: 3.4.21.64
Type de réaction: clivage protéolytique
Poids moléculaire: 28,9 kDa
Organisme d'origine: Tritirachium album
Organisme d'expression: Komagataella phaffii (Pichia pastoris)
Forme: Lyophilisat (poudre blanche)
Pureté: teneur en protéines > 70
Teneur en ADN ≤ 10 pg/mg ; ≤ 200 pg/ml
Activité: ≥ 30 U/mg (1 U = 1 mAnsonU)
Une U protéinase K hydrolyse l'hémoglobine dénaturée par l'urée et produit l'équivalent en couleur de 1 µmol de tyrosine par 1 min à 37°C et pH 7,5 (méthode Folin & Ciocalteu).
Stabilité: pH 4,0-12,5 (pH optimal : 7,5 - 8,0) ; également stable en présence d'agents dénaturants (SDS, urée).
Les ions Ca2+ (1-5 mM) protègent l'enzyme contre l'autolyse.
Activateurs: SDS, urée (l'activation par autodigestion n'est pas nécessaire).
Inhibiteurs: ions Hg2+, PMFS, phénol, DFP, inhibiteurs de trypsine ou de chymotrypsine, réactifs sulfhydrylés
Thermostabilité: actif à 37-56°C (activation optimale à 50-55°C)
Inactivation: dénaturation par la chaleur à 75°C pendant 20 min.
Stockage: -20°C
Solubilisation: 20 mg/mL : dissolution dans 50 ml d'eau distillée
20-50 mg/mL : dissolution dans un volume défini de 50 mM Tris-HCl (pH 7,5 - 8,0), 1-5 mM Ca2+ (chlorure de calcium, acétate de calcium)
ou 10 mM Tris-HCl (pH 7,5 - 8,0), 1-5 mM Ca2+ (chlorure de calcium, acétate de calcium)
Pour le stockage à long terme, ajouter 50% de glycérol.
Tampon de réaction standard: lyse cellulaire : 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM CaCl2, 0,5% SDS
Purification de l'ADN : 100 mM Tris-HCl (pH 8,0), 50 mM EDTA, 500 mM NaCl
Sécurité: H315 + H319 + H334 + H317 + H335
P260 + P280 + P342 + P311
Numéro CAS: 39450-01-6
1. comment préparer une solution de bâtonnet de protéinase K ?
20 mg/mL: Dissolvez le lyophilisat dans 50 ml d'eau distillée pour une utilisation immédiate.
Filtrez la solution de manière stérile et stockez-la aliquotée à -20°C.
20-50 mg/mL: dissoudre le lyophilisat dans un volume défini dans du Tris-HCl 50 mM (pH 7,5 - 8,0), du Ca2+ 1-5 mM (chlorure de calcium, acétate de calcium)
ou 10 mM Tris-HCl (pH 7,5 - 8,0), 1-5 mM Ca2+ (chlorure de calcium, acétate de calcium) pour une utilisation immédiate.
Filtrer la solution de manière stérile et la stocker aliquotée à -20°C.
Pour le stockage à long terme, ajoutez 50% de glycérol.
2. pour quelles applications ai-je besoin de la protéinase K ?
- Isolation d'ADN génomique à partir de queues de souris:
Tampon: Tris-HCl 20 mM (pH 8,0), NaCl 400 mM, EDTA 5 mM (pH 8,0), SDS 1%.
Concentration: 400 µg/ml de protéase K
Durée: toute la nuit
Température: 55°C
- Isolation de l'ADN génomique à partir de cellules en culture:
Tampon: 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 50 mM NaCl, 100 mM EDTA (pH 8,0), 0,5% SDS, 20 µg/ml DNase ARNse libres
Concentration: 100 µg/ml protéase K
Durée: 3h
Température: 50°C
- Isolation rapide de l'ADN génomique (matrice PCR):
Tampon: 67 mM Tris-HCl (pH 8,8), 16,6 mM sulfate d'ammonium, 5 mM β-mercaptoéthanol, 6,7 mM MgCl2, 6,7 µM EDTA (pH 8,0), 1,7 µM SDS
Concentration: 50 µg/ml protéase K
Durée: 1h
Température: 37°C
- Purification de l'ARNm avant la synthèse de l'ADNc (Augmente souvent le rendement):
Tampon: 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 50 mM NaCl, 10 mM EDTA (pH 8,0), 0,1% SDS
Concentration: 5 µg/ml protéase K
Durée: 1-2h
Température: 37°C
- Purification des amorces PCR avant le clonage:
Préparation: Amorces de PCR + 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 400 mM NaCl, 5 mM EDTA (pH 8,0), 1% SDS
Concentration: 400 µg/ml de protéase K
Durée: toute la nuit
Température: 55°C
- Purification de l'ADN plasmidique avant la transcription in vitro:
Préparation: ADN plasmidique + Tris-HCl 21 mM (pH 8,0), NaCl 50 mM, EDTA 5 mM (pH 8,0), SDS 0,5%.
Concentration: 100 µg/ml protéase K
Durée: 1h
Température: 37°C
