Proteinasi K, 1 g

Categoria: Serina endopeptidasi (idrolasi)

Numero EC: 3.4.21.64

Tipo di reazione: scissione proteolitica

Peso molecolare: 28,9 kDa

Organismo di origine: Tritirachium album

Organismo di espressione: Komagataella phaffii (Pichia pastoris)

Forma: Liofilizzato (polvere bianca)

Purezza: contenuto di proteine > 70%
                  Contenuto di DNA ≤ 10 pg/mg; ≤ 200 pg/ml

Attività: ≥ 30 U/mg (1 U = 1 mAnsonU)

Una U di proteinasi K idrolizza l'emoglobina denaturata in urea e produce l'equivalente cromatico di 1 µmol di tirosina per 1 min a 37°C e pH 7,5 (metodo di Folin & Ciocalteu).

Stabilità: pH 4,0-12,5 (pH ottimale: 7,5-8,0); stabile anche in presenza di agenti denaturanti (SDS, urea).
                   Gli ioni Ca2+ (1-5 mM) proteggono l'enzima dall'autolisi.

Attivatori: SDS, urea (l'attivazione per autodigestione non è necessaria).

Inibitori: ioni Hg2+, PMFS, fenolo, DFP, inibitori della tripsina o della chimotripsina, reagenti sulfidrilici.

Termostabilità: attivo a 37-56°C (attivazione ottimale a 50-55°C)

Inattivazione: denaturazione a caldo a 75°C per 20 min.

Conservazione: -20°C

Solubilizzazione: 20 mg/mL: Sciogliere in 50 ml di acqua distillata.
                              20-50 mg/mL: Sciogliere in un volume definito in 50 mM Tris-HCl (pH 7,5 - 8,0), 1-5 mM Ca2+ (cloruro di calcio, acetato di calcio)
                                                      o 10 mM Tris-HCl (pH 7,5-8,0), 1-5 mM Ca2+ (cloruro di calcio, acetato di calcio).

                              Per la conservazione a lungo termine, aggiungere glicerolo al 50%.

Tampone di reazione standard: lisi cellulare: 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM CaCl2, 0,5% SDS
                                              Purificazione del DNA: 100 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM EDTA, 500 mM NaCl

Sicurezza: H315 + H319 + H334 + H317 + H335
                     P260 + P280 + P342 + P311

Numero CAS: 39450-01-6

1. Come si prepara una soluzione madre di proteinasi K?

      20 mg/mL: Sciogliere il liofilizzato in 50 ml di acqua distillata per uso immediato.
                         Filtrare la soluzione in modo sterile e conservare le aliquote a -20°C.
20-50 mg/mL: sciogliere il liofilizzato in un volume definito in 50 mM Tris-HCl (pH 7,5 - 8,0), 1-5 mM Ca2+ (cloruro di calcio, acetato di calcio)
                         o 10 mM Tris-HCl (pH 7,5 - 8,0), 1-5 mM Ca2+ (cloruro di calcio, acetato di calcio) per uso immediato.
                         Filtrare la soluzione in modo sterile e conservarla in aliquote a -20°C.

                         Per la conservazione a lungo termine, aggiungere il 50% di glicerolo.

2. Per quali applicazioni è necessaria la proteinasi K?

•     Isolamento di DNA genomico da code di topo:

                        Tampone: 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 400 mM NaCl, 5 mM EDTA (pH 8.0), 1% SDS
                        Concentrazione: 400 µg/ml di proteasi K
                        Durata: Una notte
                        Temperatura: 55°C

•     Isolamento del DNA genomico da cellule coltivate:

                        Tampone: 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 100 mM EDTA (pH 8.0), 0,5% SDS, 20 µg/ml DNase free RNAse
                        Concentrazione: 100 µg/ml di proteasi K
                        Durata: 3 ore
                        Temperatura: 50°C

•     Isolamento rapido del DNA genomico (templato di PCR):

                        Tampone: 67 mM Tris-HCl (pH 8.8), 16.6 mM solfato di ammonio, 5 mM β-mercaptoetanolo, 6.7 mM MgCl2, 6.7 µM EDTA (pH 8.0), 1.7 µM SDS
                        Concentrazione: 50 µg/ml di proteasi K
                        Durata: 1 ora
                        Temperatura: 37°C

•     Purificazione dell'mRNA prima della sintesi del cDNA (spesso aumenta la resa):

                        Tampone: 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 50 mM NaCl, 10 mM EDTA (pH 8,0), 0,1% SDS
                        Concentrazione: 5 µg/ml di proteasi K
                        Durata: 1-2 ore
                        Temperatura: 37°C

•     Purificazione dei preparati PCR prima del clonaggio:

                        Preparazione: preparati PCR + 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 400 mM NaCl, 5 mM EDTA (pH 8.0), 1% SDS
                        Concentrazione: 400 µg/ml di proteasi K
                        Durata: notte
                        Temperatura: 55°C

•     Purificazione del DNA plasmidico prima della trascrizione in vitro:

                        Preparazione: DNA plasmidico + 21 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 5 mM EDTA (pH 8.0), 0,5% SDS
                        Concentrazione: 100 µg/ml di proteasi K
                        Durata: 1 ora
                        Temperatura: 37°C

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