Kategorie: Serin-Endopeptidase (Hydrolase)

EC-Nummer: 3.4.21.64

Reaktionsart: Proteolytische Spaltung

Molekulargewicht: 28,9 kDa

Ursprungsorganismus: Tritirachium album

Expressionsorganismus: Komagataella phaffii (Pichia pastoris)

Form: Lyophilisat (Weißes Pulver)

Reinheit: Proteingehalt > 70%
                  DNA-Gehalt ≤ 10 pg/mg; ≤ 200 pg/ml

Aktivität: ≥ 30 U/mg (1 U = 1 mAnsonU)

Ein U Proteinase K hydrolysiert Harnstoff-denaturiertes Hämoglobin und produziert das Farbequivalent von 1 µmol Tyrosin pro 1 min bei 37°C und pH 7.5 (Folin & Ciocalteu’s Methode)

Stabilität: pH 4,0-12,5 (pH-Optimum: 7,5 - 8,0); Auch in Anwesenheit von denaturierenden Agenzien (SDS, Harnstoff) stabil.
                   Ca²⁺-Ionen (1-5 mM) schützen das Enzym vor Autolyse.

Aktivatoren: SDS, Harnstoff (Aktivierung durch Selbstverdau ist nicht nötig)

Inhibitoren: Hg²⁺-Ionen, PMFS, Phenol, DFP, Trypsin- bzw. Chymotrypsininhibitoren, Sulfhydryl-Reagenzien

Thermostabilität: aktiv bei 37-56°C (Optimale Aktiviät bei 50-55°C)

Inaktivierung: Hitzedenaturierung bei 75°C für 20 min

Lagerung: -20°C

Solubilisierung: 20 mg/mL: Lösen in 50 ml destilliertem Wasser 
                              20–50 mg/mL: Lösen in definiertem Volumen in 50 mM Tris-HCl (pH 7,5 - 8,0), 1-5 mM Ca²⁺ (calcium chloride, calcium acetate)
                                                      oder 10 mM Tris-HCl (pH 7,5 - 8,0), 1-5 mM Ca²⁺ (calcium chloride, calcium acetate)

                              Für die für die Langzeitlagerung 50% Glycerol hinzufügen

Standardreaktionspuffer: Zelllyse: 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM CaCl₂, 0,5% SDS
                                              DNA-Reinigung: 100 mM Tris-HCl (pH 8,0), 50 mM EDTA, 500 mM NaCl

Sicherheit: H315 + H319 + H334 + H317 + H335
                     P260 + P280 + P342 + P311

CAS-Nummer: 39450-01-6

1. Wie stelle ich eine Proteinase K-Stocklösung her?

      20 mg/mL: Lösen Sie das Lyophilisat in destilliertem Wasser für den sofortigen Gebrauch.
                         Filtrieren Sie die Lösung steril und lagern Sie sie aliquotiert bei -20°C. 
20–50 mg/mL: Lösen Sie das Lyophilisat in definiertem Volumen in 50 mM Tris-HCl (pH 7,5 - 8,0), 1-5 mM Ca²⁺ (calcium chloride, calcium acetate)
                         oder 10 mM Tris-HCl (pH 7,5 - 8,0), 1-5 mM Ca²⁺ (calcium chloride, calcium acetate) für den sofortigen Gebrauch.
                         Filtrieren Sie die Lösung steril und lagern Sie sie aliquotiert bei -20°C.

                         Für die für die Langzeitlagerung fügen Sie 50% Glycerol hinzu.

2. Bei welchen Anwendungen brauche ich Proteinase K?

• Isolierung genomischer DNA aus Mausschwänzen:

                        Puffer: 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 400 mM NaCl, 5 mM EDTA (pH 8,0), 1% SDS
                        Konzentration: 400 µg/ml Protease K
                        Dauer: Über Nacht
                        Temperatur: 55°C

• Isolierung genomischer DNA aus kultivierten Zellen:

                        Puffer: 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 50 mM NaCl, 100 mM EDTA (pH 8,0), 0,5% SDS, 20 µg/ml DNase freie RNAse
                        Konzentration: 100 µg/ml Protease K
                        Dauer: 3h
                        Temperatur: 50°C

• Schnelle Isolierung genomischer DNA (PCR-Template):

                        Puffer: 67 mM Tris-HCl (pH 8,8), 16,6 mM Ammoniumsulfat, 5 mM β-Mercaptoethanol, 6,7 mM MgCl₂, 6,7 µM EDTA (pH 8,0), 1,7 µM SDS
                        Konzentration: 50 µg/ml Protease K
                        Dauer: 1h
                        Temperatur: 37°C

• Reinigung von mRNA vor der cDNA-Synthese (Steigert oftmals die Ausbeute):

                        Puffer: 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 50 mM NaCl, 10 mM EDTA (pH 8,0), 0,1% SDS
                        Konzentration: 5 µg/ml Protease K
                        Dauer: 1-2h
                        Temperatur: 37°C

• Aufreinigung von PCR-Ansätzen vor der Klonierung:

                        Ansatz: PCR-Ansätze + 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 400 mM NaCl, 5 mM EDTA (pH 8,0), 1% SDS
                        Konzentration: 400 µg/ml Protease K
                        Dauer: über Nacht
                        Temperatur: 55°C

• Aufreinigung von Plasmid-DNA vor in vitro Transkription:

                        Ansatz: Plasmid-DNA + 21 mM Tris-HCl (pH 8,0), 50 mM NaCl, 5 mM EDTA (pH 8,0), 0,5% SDS
                        Konzentration: 100 µg/ml Protease K
                        Dauer: 1h
                        Temperatur: 37°C

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