Scriptum-55 Reverse Transkriptase

Für die Synthese von cDNA-Molekülen von 100 bp bis 10 kb Länge

Im Lieferumfang sind zwei Pufferlösungen enthalten: den Reaktionspuffer „complete“ in dem bereits MgCl₂ sowie DTT zugegeben sind, sowie einen Reaktionspuffer („incomplete“) bei dem diese Reagenzien individuell zugegeben werden können um die auf Ihre individuellen Anforderungen abgestimmten optimalen Synthesebedingungen zu schaffen.

Die Reaktionstemperatur der Reversen Transkription hängt von den strukturellen Eigenschaften der RNA ab. Das Temperaturoptimum für die Synthese längerer cDNA Fragmente (> 7kb) liegt bei 50°C und ist somit ideal geeignet für Routine-Anwendungen mit einfachen bis schwierigen RNA-templates. Eine erhöhte Temperatur (maximal 55°C) sollte bei stark strukturierten RNAs verwendet werden.

Allgemein sollte die optimale Temperatur und Inkubationszeit für jede einzelne RNA angepasst werden. Das mitgeschickte Handbuch mit einem leicht verständlichen Protokoll erleichtert Ihnen die Handhabung und gibt Ihnen wichtige Informationen und Tipps.

SCRIPTUM-55, auf einen Blick:

• Für die Synthese von cDNA-Molekülen von 100 bp - 10 kb 
• Für einfache bis schwierige templates (Loop-Strukturen, repeats)
• Temperaturoptimum für die Synthese längerer cDNA Fragmente (>7kb) liegt bei 50°C
• Mögliche Synthesetemperatur bis 55°C

Warum die hohe Arbeitstemperatur so wichtig ist:

Die möglichen Sekundärstrukturen der RNA und deren Rückbildung nach dem Erhitzen erschweren die cDNA-Synthese deutlich. Anfangs wird die RNA für 10 Minuten bei max. 65 °C erhitzt und damit wird die RNA linearisiert und alle Loops werden geöffnet. Beim "chill down" kommt die Reverse Transkriptase zum Reakitonsansatz hinzu und die Reaktion startet. Die Reaktion läuft umso besser ab, je höher hier die Arbeitstemperatur gehalten werden kann. Das heißt, bei höherer Temperatur bilden sich keine oder weniger "Loops". Da die Reversen Transkriptase kein "strand displacement" besitzt fällt Sie bei einem "Loop" wieder ab und die hinter dem "Loop" befindlichen Sequenzen gehen für ein PCR-Produkt verloren. Die Schwierigkeiten, den die RNA und die Loops bei der cDNA-Synthese machen, kann man also mit einer bei hohen Temperaturen arbeitenden Reversen Transkriptase verhindern, z.B. mit der SCRIPTUM-55.