Proteinasa K, 200 mg

Categoría: Serina endopeptidasa (hidrolasa)

Número CE: 3.4.21.64

Tipo de reacción: Corte proteolítico

Peso molecular: 28,9 kDa

Organismo de origen: Tritirachium album

Organismo de expresión: Komagataella phaffii (Pichia pastoris)

Forma: Liofilizado (polvo blanco)

Pureza: Contenido en proteínas > 70%.
                  Contenido de ADN ≤ 10 pg/mg; ≤ 200 pg/ml

Actividad: ≥ 30 U/mg (1 U = 1 mAnsonU).

Una U de proteinasa K hidroliza la hemoglobina desnaturalizada con urea y produce el color equivalente a 1 µmol de tirosina por 1 min a 37°C y pH 7,5 (método de Folin & Ciocalteu)

Estabilidad: pH 4,0-12,5 (pH óptimo: 7,5 - 8,0); también estable en presencia de agentes desnaturalizantes (SDS, urea).
                   Los iones Ca2+ (1-5 mM) protegen la enzima de la autolisis.

Activadores: SDS, urea (no es necesaria la activación por autodigestión).

Inhibidores: Iones Hg2+, PMFS, fenol, DFP, inhibidores de tripsina o quimotripsina, reactivos sulfhidrilo

Termoestabilidad: activo a 37-56°C (activación óptima a 50-55°C)

Inactivación: desnaturalización térmica a 75°C durante 20 min

Conservación: -20°C

Solubilización: 20 mg/mL: Disolver en 50 ml de agua destilada
                              20-50 mg/mL: Disolver en un volumen definido en 50 mM Tris-HCl (pH 7,5 - 8,0), 1-5 mM Ca2+ (cloruro de calcio, acetato de calcio)
                                                      o 10 mM Tris-HCl (pH 7,5 - 8,0), 1-5 mM Ca2+ (cloruro cálcico, acetato cálcico)

                              Para almacenamiento a largo plazo, añadir glicerol al 50

Tampón de reacción estándar: Lisis celular: 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM CaCl2, 0,5% SDS
                                              Purificación de ADN: 100 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM EDTA, 500 mM NaCl

Seguridad: H315 + H319 + H334 + H317 + H335
                     P260 + P280 + P342 + P311

Número CAS: 39450-01-6

1. ¿cómo se prepara una solución madre de proteinasa K?

      20 mg/mL: Disolver el liofilizado en 50 ml de agua destilada para uso inmediato.
                         Filtrar la solución estérilmente y almacenar alícuotas a -20°C.
20-50 mg/mL: Disolver el liofilizado en un volumen definido en 50 mM Tris-HCl (pH 7,5 - 8,0), 1-5 mM Ca2+ (cloruro cálcico, acetato cálcico)
                         o 10 mM Tris-HCl (pH 7,5 - 8,0), 1-5 mM Ca2+ (cloruro de calcio, acetato de calcio) para uso inmediato.
                         Filtrar la solución estéril y almacenar alícuotas a -20°C.

                         Para almacenamiento a largo plazo, añadir glicerol al 50%.

2. ¿para qué aplicaciones necesito proteinasa K?

•     Aislamiento de ADN genómico de colas de ratón:

                        Tampón: 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 400 mM NaCl, 5 mM EDTA (pH 8.0), 1% SDS
                        Concentración: 400 µg/ml de proteasa K
                        Duración: Durante la noche
                        Temperatura: 55°C

•     Aislamiento de ADN genómico a partir de células cultivadas:

                        Tampón: 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 50 mM NaCl, 100 mM EDTA (pH 8,0), 0,5% SDS, 20 µg/ml ARNasa libre de DNasa
                        Concentración: 100 µg/ml de proteasa K
                        Duración: 3h
                        Temperatura: 50°C

•     Aislamiento rápido de ADN genómico (molde de PCR):

                        Tampón: 67 mM Tris-HCl (pH 8,8), 16,6 mM sulfato amónico, 5 mM β-mercaptoetanol, 6,7 mM MgCl2, 6,7 µM EDTA (pH 8,0), 1,7 µM SDS.
                        Concentración: 50 µg/ml de proteasa K
                        Duración: 1h
                        Temperatura: 37°C

•     Purificación del ARNm antes de la síntesis del ADNc (a menudo aumenta el rendimiento):

                        Tampón: 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 50 mM NaCl, 10 mM EDTA (pH 8,0), 0,1% SDS
                        Concentración: 5 µg/ml de proteasa K
                        Duración: 1-2h
                        Temperatura: 37°C

•     Purificación de las preparaciones de PCR antes de la clonación:

                        Preparación: preparaciones PCR + 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 400 mM NaCl, 5 mM EDTA (pH 8,0), 1% SDS
                        Concentración: 400 µg/ml de proteasa K
                        Duración: toda la noche
                        Temperatura: 55°C

•     Purificación del ADN plasmídico antes de la transcripción in vitro:

                        Preparación: ADN plasmídico + 21 mM Tris-HCl (pH 8,0), 50 mM NaCl, 5 mM EDTA (pH 8,0), 0,5% SDS
                        Concentración: 100 µg/ml de proteasa K
                        Duración: 1h
                        Temperatura: 37°C

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