Proteinasa K, 1 g
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- Article number BS20.2505
Proteinasa K (1 g)
Liofilizado, ≥ 30 U/mg; Enzima recombinante; Expresada en Komagataella phaffii (Pichia pastoris); MW: 28,9 kDa.
Sinónimos
Endopeptidasa K, Pro-k, Proteinasa K
Descripción del producto
Nuestra proteinasa K es una serina proteasa inespecífica con una actividad proteolítica muy elevada (30 U/mg). La enzima fue expresada en Komagataella phaffii (Pichia pastoris) y está libre de nucleasas endógenas (DNAsas, RNAsas) y exonucleasas. Debido a su alta eficacia en la digestión de proteínas nativas, la proteasa es muy adecuada para el aislamiento de ADN genómico a partir de células cultivadas o tejidos (por ejemplo, colas de ratón) y para la inactivación fiable de nucleasas endógenas (ADNsas, ARNsas) durante la preparación de ADN/ARN.
Propiedades
- Alta estabilidad en un amplio rango de pH (4,0 - 12,5; óptimo a pH 7,5 - 8,0)
- Alta actividad a temperaturas de hasta 56°C y en condiciones desnaturalizantes (activo en presencia de SDS, urea y EDTA)
- Alta eficacia a dosis bajas (50-100 µg/ml suficientes para la mayoría de las aplicaciones)
Conviene saber
La proteinasa K es secretada por cultivos del hongo moho Tritirachium album y sirve de forma natural a la digestión de la queratina ('K') del hongo para cubrir su balance de carbono y nitrógeno. La proteinasa K está estabilizada estructuralmente por iones Ca2+ y escinde preferentemente enlaces peptídicos de aminoácidos alifáticos, aromáticos u otros aminoácidos hidrófobos (C-terminal). En ausencia de iones Ca2+, la proteinasa K muestra una actividad ligeramente reducida. Sin embargo, la actividad global sigue siendo elevada, por lo que la digestión de la proteinasa K también puede llevarse a cabo en presencia de EDTA. Los agentes desnaturalizantes como el SDS o la urea sirven como activadores de la enzima. La actividad de la proteinasa es inhibida por iones Hg2+, DFP, PMSF, fenol, reactivos sulfhidrilos e inhibidores de tripsina o quimotripsina.
Encontrará ejemplos de aplicación de la proteinasa K en Preguntas frecuentes.
Categoría: Serina endopeptidasa (hidrolasa)
Número CE: 3.4.21.64
Tipo de reacción: Corte proteolítico
Peso molecular: 28,9 kDa
Organismo de origen: Tritirachium album
Organismo de expresión: Komagataella phaffii (Pichia pastoris)
Forma: Liofilizado (polvo blanco)
Pureza: Contenido en proteínas > 70%.
Contenido de ADN ≤ 10 pg/mg; ≤ 200 pg/ml
Actividad: ≥ 30 U/mg (1 U = 1 mAnsonU).
Una U de proteinasa K hidroliza la hemoglobina desnaturalizada con urea y produce el color equivalente a 1 µmol de tirosina por 1 min a 37°C y pH 7,5 (método de Folin & Ciocalteu)
Estabilidad: pH 4,0-12,5 (pH óptimo: 7,5 - 8,0); también estable en presencia de agentes desnaturalizantes (SDS, urea).
Los iones Ca2+ (1-5 mM) protegen la enzima de la autolisis.
Activadores: SDS, urea (no es necesaria la activación por autodigestión).
Inhibidores: Iones Hg2+, PMFS, fenol, DFP, inhibidores de tripsina o quimotripsina, reactivos sulfhidrilo
Termoestabilidad: activo a 37-56°C (activación óptima a 50-55°C)
Inactivación: desnaturalización térmica a 75°C durante 20 min
Conservación: -20°C
Solubilización: 20 mg/mL: Disolver en 50 ml de agua destilada
20-50 mg/mL: Disolver en un volumen definido en 50 mM Tris-HCl (pH 7,5 - 8,0), 1-5 mM Ca2+ (cloruro de calcio, acetato de calcio)
o 10 mM Tris-HCl (pH 7,5 - 8,0), 1-5 mM Ca2+ (cloruro cálcico, acetato cálcico)
Para almacenamiento a largo plazo, añadir glicerol al 50
Tampón de reacción estándar: Lisis celular: 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM CaCl2, 0,5% SDS
Purificación de ADN: 100 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM EDTA, 500 mM NaCl
Seguridad: H315 + H319 + H334 + H317 + H335
P260 + P280 + P342 + P311
Número CAS: 39450-01-6
1. ¿cómo se prepara una solución madre de proteinasa K?
20 mg/mL: Disolver el liofilizado en 50 ml de agua destilada para uso inmediato.
Filtrar la solución estérilmente y almacenar alícuotas a -20°C.
20-50 mg/mL: Disolver el liofilizado en un volumen definido en 50 mM Tris-HCl (pH 7,5 - 8,0), 1-5 mM Ca2+ (cloruro cálcico, acetato cálcico)
o 10 mM Tris-HCl (pH 7,5 - 8,0), 1-5 mM Ca2+ (cloruro de calcio, acetato de calcio) para uso inmediato.
Filtrar la solución estéril y almacenar alícuotas a -20°C.
Para almacenamiento a largo plazo, añadir glicerol al 50%.
2. ¿para qué aplicaciones necesito proteinasa K?
- Aislamiento de ADN genómico de colas de ratón:
Tampón: 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 400 mM NaCl, 5 mM EDTA (pH 8.0), 1% SDS
Concentración: 400 µg/ml de proteasa K
Duración: Durante la noche
Temperatura: 55°C
- Aislamiento de ADN genómico a partir de células cultivadas:
Tampón: 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 50 mM NaCl, 100 mM EDTA (pH 8,0), 0,5% SDS, 20 µg/ml ARNasa libre de DNasa
Concentración: 100 µg/ml de proteasa K
Duración: 3h
Temperatura: 50°C
- Aislamiento rápido de ADN genómico (molde de PCR):
Tampón: 67 mM Tris-HCl (pH 8,8), 16,6 mM sulfato amónico, 5 mM β-mercaptoetanol, 6,7 mM MgCl2, 6,7 µM EDTA (pH 8,0), 1,7 µM SDS.
Concentración: 50 µg/ml de proteasa K
Duración: 1h
Temperatura: 37°C
- Purificación del ARNm antes de la síntesis del ADNc (a menudo aumenta el rendimiento):
Tampón: 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 50 mM NaCl, 10 mM EDTA (pH 8,0), 0,1% SDS
Concentración: 5 µg/ml de proteasa K
Duración: 1-2h
Temperatura: 37°C
- Purificación de las preparaciones de PCR antes de la clonación:
Preparación: preparaciones PCR + 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 400 mM NaCl, 5 mM EDTA (pH 8,0), 1% SDS
Concentración: 400 µg/ml de proteasa K
Duración: toda la noche
Temperatura: 55°C
- Purificación del ADN plasmídico antes de la transcripción in vitro:
Preparación: ADN plasmídico + 21 mM Tris-HCl (pH 8,0), 50 mM NaCl, 5 mM EDTA (pH 8,0), 0,5% SDS
Concentración: 100 µg/ml de proteasa K
Duración: 1h
Temperatura: 37°C