Proteinas K, 200 mg

Kategori: Serin endopeptidas (hydrolas)

EC-nummer: 3.4.21.64

Reaktionstyp: Proteolytisk klyvning

Molekylvikt: 28,9 kDa

Ursprungsorganism: Tritirachium album

Uttrycksorganism: Komagataella phaffii (Pichia pastoris)

Form: Lyofilisat (vitt pulver)

Renhet: Proteinhalt > 70
                  DNA-innehåll ≤ 10 pg/mg; ≤ 200 pg/ml

Aktivitet: ≥ 30 U/mg (1 U = 1 mAnsonU)

Ett U proteinas K hydrolyserar urea-denaturerat hemoglobin och producerar färg motsvarande 1 µmol tyrosin per 1 min vid 37°C och pH 7,5 (Folin & Ciocalteu's metod)

Stabilitet: pH 4,0-12,5 (pH-optimum: 7,5 - 8,0); även stabil i närvaro av denatureringsmedel (SDS, urea).
                   Ca2+-joner (1-5 mM) skyddar enzymet från autolys.

Aktiverare: SDS, urea (aktivering genom självdigestion är inte nödvändig)

Inhibitorer: Hg2+-joner, PMFS, fenol, DFP, trypsin- eller chymotrypsininhibitorer, sulfhydrylreagenser

Termostabilitet: aktiv vid 37-56°C (optimal aktivering vid 50-55°C)

Inaktivering: värmedenaturering vid 75°C i 20 min

Förvaring: -20°C

Solubilisering: 20 mg/mL: Löses i 50 ml destillerat vatten
                              20-50 mg/mL: Löses i en definierad volym i 50 mM Tris-HCl (pH 7,5 - 8,0), 1-5 mM Ca2+ (kalciumklorid, kalciumacetat)
                                                      eller 10 mM Tris-HCl (pH 7,5 - 8,0), 1-5 mM Ca2+ (kalciumklorid, kalciumacetat)

                              För långtidsförvaring, tillsätt 50% glycerol

Standardreaktionsbuffert: Celllys: 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM CaCl2, 0,5 % SDS
                                              DNA-rening: 100 mM Tris-HCl (pH 8,0), 50 mM EDTA, 500 mM NaCl

Säkerhet: H315 + H319 + H334 + H317 + H335
                     P260 + P280 + P342 + P311

CAS-nummer: 39450-01-6

1. Hur bereder jag en stamlösning av proteinas K?

      20 mg/mL: Lös upp lyofilisatet i 50 ml destillerat vatten för omedelbar användning.
                         Filtrera lösningen sterilt och förvara alikvoter vid -20°C.
20-50 mg/mL: Lös upp lyofilisatet i en definierad volym i 50 mM Tris-HCl (pH 7,5 - 8,0), 1-5 mM Ca2+ (kalciumklorid, kalciumacetat)
                         eller 10 mM Tris-HCl (pH 7,5 - 8,0), 1-5 mM Ca2+ (kalciumklorid, kalciumacetat) för omedelbar användning.
                         Filtrera lösningen sterilt och förvara den som alikvot vid -20°C.

                         För långtidsförvaring, tillsätt 50% glycerol.

2. För vilka tillämpningar behöver jag proteinas K?

•     Isolering av genomiskt DNA från mussvansar:

                        Buffert: 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 400 mM NaCl, 5 mM EDTA (pH 8,0), 1 % SDS
                        Koncentration: 400 µg/ml proteas K
                        Varaktighet: Över natten
                        Temperatur: 55°C

•     Isolering av genomiskt DNA från odlade celler:

                        Buffert: 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 50 mM NaCl, 100 mM EDTA (pH 8,0), 0,5 % SDS, 20 µg/ml DNAS-fri RNAse
                        Koncentration: 100 µg/ml proteas K
                        Varaktighet: 3 timmar
                        Temperatur: 50 °C

•     Snabb isolering av genomiskt DNA (PCR-mall):

                        Buffert: 67 mM Tris-HCl (pH 8,8), 16,6 mM ammoniumsulfat, 5 mM β-mercaptoetanol, 6,7 mM MgCl2, 6,7 µM EDTA (pH 8,0), 1,7 µM SDS
                        Koncentration: 50 µg/ml proteas K
                        Varaktighet: 1 timme
                        Temperatur: 37°C

•     Rening av mRNA före cDNA-syntes (ökar ofta utbytet):

                        Buffert: 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 50 mM NaCl, 10 mM EDTA (pH 8,0), 0,1 % SDS
                        Koncentration: 5 µg/ml proteas K
                        Varaktighet: 1-2 timmar
                        Temperatur: 37 °C

•     Rening av PCR-preparat före kloning:

                        Beredning: PCR-preparat + 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 400 mM NaCl, 5 mM EDTA (pH 8,0), 1 % SDS
                        Koncentration: 400 µg/ml proteas K
                        Varaktighet: över natten
                        Temperatur: 55°C

•     Rening av plasmid-DNA före in vitro-transkription:

                        Beredning: plasmid-DNA + 21 mM Tris-HCl (pH 8,0), 50 mM NaCl, 5 mM EDTA (pH 8,0), 0,5 % SDS
                        Koncentration: 100 µg/ml proteas K
                        Varaktighet: 1 timme
                        Temperatur: 37 °C

• Datenblatt in einem neuen Fenster öffnen