Proteinase K, 1 g

Kategori: Serin-endopeptidase (hydrolase)

EC-nummer: 3.4.21.64

Reaksjonstype: Proteolytisk spalting

Molekylvekt: 28,9 kDa

Opprinnelsesorganisme: Tritirachium album

Uttrykksorganisme: Komagataella phaffii (Pichia pastoris)

Form: Lyofilisat (hvitt pulver)

Renhet: Proteininnhold > 70 %.
                  DNA-innhold ≤ 10 pg/mg; ≤ 200 pg/ml

Aktivitet: ≥ 30 U/mg (1 U = 1 mAnsonU)

Én U proteinase K hydrolyserer urea-denaturert hemoglobin og produserer fargeekvivalenten til 1 µmol tyrosin per 1 min ved 37 °C og pH 7,5 (Folin & Ciocalteus metode).

Stabilitet: pH 4,0-12,5 (pH-optimum: 7,5 - 8,0); også stabil i nærvær av denatureringsmidler (SDS, urea).
                   Ca2+-ioner (1-5 mM) beskytter enzymet mot autolyse.

Aktivatorer: SDS, urea (aktivering ved selvfordøyelse er ikke nødvendig).

Inhibitorer: Hg2+-ioner, PMFS, fenol, DFP, trypsin- eller chymotrypsinhemmere, sulfhydrylreagenser.

Termostabilitet: aktiv ved 37-56 °C (optimal aktivering ved 50-55 °C)

Inaktivering: Varmedenaturering ved 75 °C i 20 min.

Oppbevaring: -20 °C

Løseliggjøring: 20 mg/mL: Oppløses i 50 ml destillert vann.
                              20-50 mg/mL: Oppløses i et definert volum i 50 mM Tris-HCl (pH 7,5 - 8,0), 1-5 mM Ca2+ (kalsiumklorid, kalsiumacetat)
                                                      eller 10 mM Tris-HCl (pH 7,5 - 8,0), 1-5 mM Ca2+ (kalsiumklorid, kalsiumacetat).

                              For langtidslagring, tilsett 50 % glyserol

Standard reaksjonsbuffer: Cellelysering: 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM CaCl2, 0,5 % SDS
                                              DNA-rensing: 100 mM Tris-HCl (pH 8,0), 50 mM EDTA, 500 mM NaCl

Sikkerhet: H315 + H319 + H334 + H317 + H335
                     P260 + P280 + P342 + P311

CAS-nummer: 39450-01-6

1. Hvordan lager jeg en stamløsning av proteinase K?

      20 mg/mL: Løs opp lyofilisatet i 50 ml destillert vann for umiddelbar bruk.
                         Filtrer løsningen sterilt og oppbevar alikvoter ved -20 °C.
20-50 mg/mL: Løs opp lyofilisatet i et definert volum i 50 mM Tris-HCl (pH 7,5 - 8,0), 1-5 mM Ca2+ (kalsiumklorid, kalsiumacetat)
                         eller 10 mM Tris-HCl (pH 7,5 - 8,0), 1-5 mM Ca2+ (kalsiumklorid, kalsiumacetat) for umiddelbar bruk.
                         Filtrer løsningen sterilt og oppbevar den alikvotert ved -20 °C.

                         For langtidslagring, tilsett 50 % glyserol.

2. Til hvilke bruksområder trenger jeg Proteinase K?

•     Isolering av genomisk DNA fra musehaler:

                        Buffer: 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 400 mM NaCl, 5 mM EDTA (pH 8,0), 1 % SDS.
                        Konsentrasjon: 400 µg/ml protease K
                        Varighet: Over natten
                        Temperatur: 55 °C

•     Isolering av genomisk DNA fra dyrkede celler:

                        Buffer: 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 50 mM NaCl, 100 mM EDTA (pH 8,0), 0,5 % SDS, 20 µg/ml DNasefri RNAse
                        Konsentrasjon: 100 µg/ml protease K
                        Varighet: 3 timer
                        Temperatur: 50 °C

•     Rask isolering av genomisk DNA (PCR-template):

                        Buffer: 67 mM Tris-HCl (pH 8,8), 16,6 mM ammoniumsulfat, 5 mM β-mercaptoetanol, 6,7 mM MgCl2, 6,7 µM EDTA (pH 8,0), 1,7 µM SDS.
                        Konsentrasjon: 50 µg/ml protease K
                        Varighet: 1 time
                        Temperatur: 37 °C

•     Rensing av mRNA før cDNA-syntese (øker ofte utbyttet):

                        Buffer: 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 50 mM NaCl, 10 mM EDTA (pH 8,0), 0,1% SDS
                        Konsentrasjon: 5 µg/ml protease K
                        Varighet: 1-2 timer
                        Temperatur: 37 °C

•     Rensing av PCR-preparater før kloning:

                        Tilberedning: PCR-preparater + 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 400 mM NaCl, 5 mM EDTA (pH 8,0), 1 % SDS
                        Konsentrasjon: 400 µg/ml protease K
                        Varighet: over natten
                        Temperatur: 55 °C

•     Rensing av plasmid-DNA før in vitro-transkripsjon:

                        Tilberedning: plasmid-DNA + 21 mM Tris-HCl (pH 8,0), 50 mM NaCl, 5 mM EDTA (pH 8,0), 0,5 % SDS
                        Konsentrasjon: 100 µg/ml protease K
                        Varighet: 1 time
                        Temperatur: 37 °C

• Datenblatt in einem neuen Fenster öffnen